| Реферат |
ОПИСАНИЕ
изобретения для государственной регистрации и выдачи патента на
изобретение от ООО НИЦ «Инновации», город Новосибирск
Реферат
Изобретение «Диагностическая тест-полоска для оперативного выявления
фитопатогена в растительном материале» относится к области защиты растений, к
способу экспресс-диагностики возбудителей вирусных заболеваний овощных культур
защищённого грунта (огурец, томат, перец, салат), который позволяет оперативно с
минимальными временными, квалификационными и экономическими затратами
определить наличие или отсутствие даже незначительного количества частиц возбудителей
вирусных заболеваний овощных культур в защищённом грунте. Диагностическая тестполоска для оперативного выявления фитопатогена в растительном материале является
полностью российской разработкой, призванной обеспечить импортозамещение
существующих иностранных аналогов, отличающихся дороговизной и недоступностью для
российских производителей овощной продукции в защищённом грунте, поскольку другие
отечественные аналоги с заявленными качествами на рынке отсутствуют.
Сущность изобретения состоит в том, что в основу механизма обнаружения
фитопатогенных вирусов положен иммунохроматографический анализ (ИХА), проводимый
по методу тонкослойной хроматографии и основанный на визуально фиксируемой реакции
между антигеном вируса-возбудителя и соответствующим ему специфичным
поликлональным антителом в биологических материалах, позволяющий с большой
точностью определить наличие или отсутствие конкретного вида и/или штамма вируса,
вызывающего болезни овощных культур. Существенной особенностью данного
изобретения является то, что для наработки антител, необходимых для аналитической зоны
диагностической тест-полоски для оперативного выявления фитопатогена в растительном
материале, используют аффинно-очищенные поликлональные антивирусные антитела,
полученные щадящим методом сохранения жизни животных из яиц кур, которых
иммунизировали инъекциями с сывороткой, содержащей антигены целевых вирусоввозбудителей заболеваний овощных культур защищённого грунта, в результате наработки и
забора антител животные не страдают и продолжают оставаться длительное время
продуктивными (яйценоскими).
Данное изобретение позволяет успешно отслеживать распространение вирусов
среди овощных культур защищённого грунта, осуществлять своевременный мониторинг
для оперативного реагирования и контролировать появление карантинных на территории
РФ вирусных патогенов для принятия оперативных мер защиты растений. Указанное
изобретение возможно применять как в условиях промышленных тепличных комбинатов и
комплексов, так и в условиях фермерских и личных подсобных хозяйств при производстве
овощей.
Раздел 1. Название изобретения, класс МПК (международная патентная
классификация) и его назначение
Наименование изобретения «Диагностическая тест-полоска для оперативного
выявления фитопатогена в растительном материале».
Класс МПК (международной патентной классификации): Код МПК A01G 13/00 /
Международная патентная классификация / Защита растений:
Раздел A УДОВЛЕТВОРЕНИЕ ЖИЗНЕННЫХ ПОТРЕБНОСТЕЙ ЧЕЛОВЕКА;
Класс A01 Сельское хозяйство; лесное хозяйство; животноводство; охота; отлов животных;
рыболовство и рыбоводство; Подкласс A01G Садоводство; разведение овощей, цветов,
риса, фруктов, винограда, хмеля или морских водорослей; лесное хозяйство; орошение
(сбор фруктов, овощей, хмеля и т.п.); Группа A01G Защита растений; Подгруппа 13/00.
Назначение изобретения: Российская тест-полоска для экспресс-диагностики
возбудителей вирусных заболеваний овощных культур защищённого грунта.
Раздел 2. Область техники
Изобретение относится к области защиты растений, к способу экспресс-диагностики
возбудителей вирусных заболеваний овощных культур защищённого грунта, который
позволяет оперативно с минимальными временными, квалификационными и
экономическими затратами определить наличие или отсутствие даже незначительного
количества частиц возбудителей вирусных заболеваний овощных культур в защищённом
грунте. Использование в промышленном производстве представленного изобретения
позволяет предотвратить неконтролируемые экспоненциальные вспышки вирусных
заболеваний овощных культур в тепличных комбинатах, способные приводить к 20-100%
потерям урожая [1]; [2], посредством своевременной диагностики первых симптомов,
выявления патогенных вирусов и принятия своевременных мер борьбы. Данное
изобретение позволяет успешно отслеживать распространение вирусов среди овощных
культур защищённого грунта, осуществлять своевременный мониторинг для оперативного
реагирования и контролировать появление карантинных на территории РФ вирусных
патогенов с соответствующими мерами защиты. Указанное изобретение возможно
применять как в условиях промышленных тепличных комбинатов и комплексов, так и в
условиях фермерских и личных подсобных хозяйств при производстве овощей.
Раздел 3. Сущность изобретения: характеристики, конструкция, отличия от
аналогов
Диагностическая тест-полоска для оперативного выявления фитопатогена в
растительном материале является полностью российской разработкой, призванной
обеспечить импортозамещение существующих иностранных аналогов, отличающихся
дороговизной и недоступностью для российских производителей овощной продукции,
поскольку другие отечественные аналоги тест-полоски с заявленными качествами на рынке
отсутствуют. Сущность изобретения состоит в том, что в основу механизма обнаружения
фитопатогенных вирусов положен иммунохроматографический анализ (ИХА), проводимый
по методу тонкослойной хроматографии и основанный на визуально фиксируемой реакции
между антигеном вируса-возбудителя и соответствующим ему специфичным
поликлональным антителом в биологических материалах, позволяющий с большой
точностью определить наличие или отсутствие конкретного вида и/или штамма вируса,
вызывающего болезни овощных культур в защищённом грунте (огурец, томат, перец, салат).
Существенной особенностью данного изобретения является то, что для наработки
антител, необходимых для аналитической зоны диагностической тест-полоски для
оперативного выявления фитопатогена в растительном материале, используют аффинноочищенные поликлональные антитела к рекомбинантному аналогу поверхностного
антигена вируса из желтка яиц иммунизированных кур (IgY антитела). Рекомбинантные
белки вирусов растений получают в клетках бактерии Escherichia coli за счет встройки
модифицированной экспрессионной кассеты (плазмиды) и производят иммунизацию
животных. Таким образом, получение целевых антител к вирусам-возбудителям
заболеваний овощных культур в защищенном грунте выполняется щадящим методом с
сохранением жизни животных. В результате наработки и забора антител животные не
страдают и продолжают оставаться длительное время продуктивными (яйценоскими) и
продолжительно сохраняют искусственно выработанный иммунитет, что позволяет
организовать непрерывный процесс наработки и получения сырья поликлональных
антител, постоянно требующихся для производства тест-полосок в промышленных
масштабах.
Диагностическая тест-полоска для оперативного выявления фитопатогена в
растительном материале представляет собой мультимембранный композит, собранный из
мембраны, адсорбирующей растительный биоматериал, предварительно измельчённый в
пакете для гомогенизации и экстрагированный буферным раствором, на которую наносится
анализируемая проба; подложки под конъюгат, на которую наносится конъюгат маркера с
рецепторными молекулами (антителами к конкретному штамму/виду фитовируса); рабочей
мембраны с иммобилизованными специфическими реагентами, взаимодействующими с
аналитом (растительным биоматериалом); конечной адсорбирующей мембраны,
впитывающей жидкость, протекающую через рабочую мембрану. Схема
иммунохроматографической серодиагностики с помощью тест-полоски для оперативного
выявления фитопатогена в растительном материале заключается в следующем: тестируемая
проба растительного биоматериала, экстрагированного буферным раствором, впитывается
мембранами тест-полоски. Продвигаясь через различные участки мультимембранного
композита под действием капиллярных сил, тестируемая проба растительного
биоматериала сначала смешивается с частицами маркера, на поверхности которого
иммобилизован иммуноглобулин-связывающий реагент (аффинно-очищенные
поликлональные антивирусные антитела), в результате чего этот маркерный конъюгат
связывается с антивирусными иммуноглобулинами пробы. Образовавшийся в результате
этой реакции окрашенный комплекс вместе с током жидкости достигает участка мембраны
с иммобилизованным антигеном патогена (аналитическая зона) и после связывания с
проверяемым антигеном фитовируса, окрашивает этот участок. Интенсивность
окрашивания отражает концентрацию в пробе специфических противовирусных антител
(антител к используемому антигену) и их аффинность, что свидетельствует о низком или
высоком количестве вирусных частиц в исследуемом образце (количественный анализ).
Для проверки работоспособности используемого конъюгата и сохранения
функциональности, в тест-полоску для оперативного выявления фитопатогена в
растительном материале встроена расположенная далее контрольная зона, в которой
реагент, сорбированный на частицах коллоидного золота, связывается с иммобилизованным
на мембране реагентом – антивидовыми антителами к искомому фитовирусу. Маркерный
конъюгат, не связавшийся с антигеном в аналитической зоне полоски, протекает далее и в
контрольной зоне взаимодействует с антивидовыми антителами к искомому фитовирусу,
что проявляется окрашиванием контрольной зоны и подтверждает правильность
проведения тестирования и сохранения конъюгатом реакционной способности.
Поскольку отечественные аналоги подобных тест-полосок, ориентированные на
оперативное определение наличия фитопатогена в овощных культурах защищённого грунта
на рынке отсутствуют, в качестве наиболее близких аналогов были выбраны известные и
широко применяемые ранее иностранные аналоги тест-полоски, обладающие похожими
свойствами, которые производит во Франции [3] и Германии [4]. Близким аналогом тестполосок российского производства можно считать иммуноферментные диагностические
наборы для выявления, идентификации и количественного определения только вирусов
картофеля [5].
Существенными недостатками известных иностранных аналогов являются
дороговизна, обусловленная высокой себестоимостью, включающей значительные
технологические, производственные и прочие затраты на выпуск готовой продукции,
возникающие в связи с используемой технологией наработки, очистки, проверки на
специфичность моноклональных и поликлональных антител; недоступность для
овощеводов защищённого грунта, продиктованная современной санкционной политикой
недружественных стран-производителей. Иностранные аналоги производят, получая
моноклональные и поликлональные антитела к искомому вирусу через забор крови
предварительно иммунизированных кроликов, что является нещадящим методом, в
результате использования которого животные чаще всего погибают. Существующие
иностранные аналоги работают по принципам иммунохроматографического анализа
(ИХА), иммуноферментного анализа (ИФА), и/или полимеразной цепной реакции (ПЦР);
проведение последних требует наличия специализированного дорогостоящего
лабораторного аналитического оборудования со специфическими расходными
материалами, высокой квалификации лабораторного персонала, отличаются более
длительной технологией наработки и подготовки антител и антигенов для производства
тест-полосок, требуют на проведение анализа одного растительного образца существенных
временных затрат (от нескольких часов до нескольких суток), что в конечном итоге
сказывается на их себестоимости; кроме того, текущая геополитическая обстановка сделала
иностранные аналоги недоступными для российских товаропроизводителей. Аналог
российского производства ориентирован на проведение иммуноферментной диагностики
для выявления, идентификации и количественного определения только вирусов картофеля
с использованием специфических антивирусных кроличьих антител, что является
существенными недостатками технологии.
Отличительные особенности настоящего изобретения состоят в том, что
представленная диагностическая тест-полоска, основанная на иммунохроматографическом
анализе биоматериала, позволяет посредством использования только поликлональных
антител добиться высокой специфичности реакции обнаружения антигенов растительных
вирусов и их отдельных штаммов за счёт их полной комплиментарности к различным
детерминантам вирусного антигена, что гарантирует достоверный результат анализа даже
при очень малом количестве вирусных частиц и минимальном размере анализируемого
образца. Диагностическая тест-полоска, работающая на основе
иммунохроматографического анализа (ИХА) растительного материала, позволяет очень
быстро, в течение получаса, провести достоверную качественную оценку наличия или
отсутствия вируса в данном растении; выполнение анализа не требует высокой
квалификации сотрудников, специального оборудования, наличия и комплектования
дорогостоящей лаборатории. Использование данного изобретения экономически выгодно
предприятию, поскольку себестоимость диагностики вирусных заболеваний овощных
культур с помощью ИХА тест-полоски гораздо дешевле, чем лабораторная диагностика
другими методами (ИФА, ПЦР). В конечном итоге применение данного изобретения
приводит к снижению общих производственных затрат и себестоимости продукции, что
положительно сказывается на рентабельности производства. Своевременно проведённая
диагностика представленными тест-полосками в случае обнаружения фитопатогенных
вирусов позволяет оперативно принять организационные решения по применению мер
борьбы с выявленными возбудителями болезней овощных культур в защищённом грунте,
что существенно снижает потери урожая и недополучение прибыли в связи с негативным
влиянием этих биотических факторов.
Раздел 4. Иллюстрации: чертежи, схемы, фотографии, рисунки
Схема интерпретации результатов тестирования растительного образца, показанная
на рисунке 1, помогает пользователю расшифровать результаты проверки аналита на
наличие или отсутствие вирусных частиц и корректность работы тест-полоски, вставленной
в пластиковый корпус для удобства пользования, облегчения процесса анализа и
исключения попадания анализируемого раствора в другую зону тест-полоски, что может
привести к некорректному результату тестирования.
Рисунок 1 – Интерпретация результатов тестирования растительного образца [6]
Раздел 5. Технический результат, который достигается при внедрении объекта
Техническими проблемами, решаемыми предлагаемым изобретением, являются:
- усовершенствование способа наработки, очистки и подготовки антител,
необходимых для аналитической зоны диагностической тест-полоски, пригодного для
массового промышленного производства;
- усовершенствование способа получения рекомбинантных белков вирусов растений
в клетках бактерии Escherichia coli за счет встройки модифицированной экспрессионной
кассеты (плазмиды) для последующего выполнения иммунизации животных;
- получение целевых антител к вирусам-возбудителям заболеваний овощных культур
щадящим методом с сохранением здоровья и жизни животных.
Технический результат, достигаемый данным изобретением представлен в виде
созданной, испытанной в лабораторных условиях и в условиях производства (подтверждено
актами производственных испытаний) диагностической тест-полоски для оперативного
выявления фитопатогена в растительном материале, которая заключена в пластиковый
корпус для удобства пользования, облегчения процесса анализа и исключения попадания
анализируемого раствора в другую зону тест-полоски, что может привести к некорректному
результату тестирования.
Заявленный технический результат достигается за счёт того, что разработка,
испытание, производство и внедрение в сельское хозяйство диагностической тест-полоски
для оперативного выявления фитопатогена в растительном материале, механизм действия
которой основан на применении альтернативного способа наработки, очистки и подготовки
антител, необходимых для аналитической зоны диагностической тест-полоски, для чего
используют аффинно-очищенные поликлональные антитела к рекомбинантному аналогу
поверхностного антигена искомого вируса из желтка яиц иммунизированных кур (IgY
антитела) через иммунизацию кур и получение поликлональных антител в яйцах;
полученные таким образом антитела обладают высокой специфичностью к конкретному
штамму/виду вируса, вызывающего серьёзные и опасные заболевания овощных культур в
защищённом грунте, которые могут привести к 100% потере урожая. Кроме того, данная
технология включает получение рекомбинантных белков вирусов растений в клетках
бактерии Escherichia coli за счет встройки модифицированной экспрессионной кассеты
(плазмиды) для выполнения иммунизации животных (кур). Таким образом, получение
целевых антител к вирусам-возбудителям заболеваний овощных культур в защищенном
грунте выполняется щадящим методом с сохранением жизни животных. В результате
наработки и забора антител животные не страдают и продолжают оставаться длительное
время продуктивными (яйценоскими) и продолжительно сохраняют искусственно
выработанный иммунитет, что позволяет организовать непрерывный процесс наработки и
получения сырья поликлональных антител, постоянно требующихся для производства тестполосок в промышленных масштабах.
Диагностическая тест-полоска для оперативного выявления фитопатогена в
растительном материале является универсальным способом экспресс-диагностики наличия
или отсутствия возбудителей вирусных заболеваний овощных культур защищённого грунта,
который можно использовать в различных условиях. Данное изобретение позволяет
успешно отслеживать распространение вирусов среди овощных культур защищённого
грунта, осуществлять своевременный мониторинг для оперативного реагирования и
контролировать появление карантинных на территории РФ вирусных патогенов для
принятия оперативных мер защиты растений. Указанное изобретение возможно применять
как в условиях промышленных тепличных комбинатов и комплексов, так и в условиях
фермерских и личных подсобных хозяйств при производстве овощей.
Схема применения диагностической тест-полоски для оперативного выявления
фитопатогена в растительном материале представлена несколькими вариантами, которые
позволяют провести ускоренную диагностику и принять меры профилактики или
своевременно отреагировать при разных уровнях эпифитотического процесса. Первый
вариант применения позволяет минимизировать потери урожая и существенно снизить
экономические затраты на внедрение изобретения и введение мер реагирования начиная с
инкубационного периода, когда заболевание ещё не проявилось на растении через
симптомы, а вирусные частицы уже внедрились в растение и накапливаются в клетках, при
этом профилактические мероприятия показывают лучший эффект. Второй вариант
применения желателен при появлении первых признаков заражения растения или
обнаружения первых растений с характерной симптоматикой, когда своевременные меры
борьбы помогают снизить хозяйственно ощутимые потери урожая и сохранить
себестоимость продукции на допустимом уровне. Третий вариант применения возможен
даже при экспоненциальном характере нарастания симптомов и количества поражённых
растений в популяции, когда быстрое и точное определение возбудителя имеет большое
значение для введения карантинных и истребительных мероприятий, что позволяет спасти
оставшуюся популяцию растений и не допустить значительного снижения урожая или 100%
гибели всех растений и тем самым избежать тотального ущерба для производства, когда
введение любых мер борьбы уже невыгодно с экономической точки зрения.
Раздел 6. Авторский коллектив:
Блажко Н.В.,
Вышегуров С.Х.,
Величко А.Ю.,
Биктимирова Е.В.
Раздел 7. Библиографический список
1. Nagendran K., Pandey K.K., Rai A.B., Singh B. 2017. Viruses of Vegetable Crops:
Symptomatology, Diagnostics and Management. IIVR Technical Bulletin № 75, IIVR,
Varanasi, pp.48.
2. Блажко, Н.В. Вирусы растений / Н.В. Блажко; ООО НИЦ «Инновации». – М.:
Издательство «Перо», 2024. – 138 с. : ил. – Библиогр.: с. 130–136. – 100 экз. – ISBN
978-5-00244-418-2. – Текст : непосредственный.
3. Detect quickly Plant pathogens and GMO with ImmunoStrip® : сайт / Agdia
EMEA. – Soisy sur Seine, France, 2013 – . URL: https://www.agdia-emea.com/en (дата
обращения: 16.12.2025). — Текст : электронный.
4. Solutions for Plant Disease Diagnostics. Explore our LOEWE®FAST Series... :
сайт / LOEWE®Biochemica GmbH. – Sauerlach, Germany, 1990 – . URL: https://loeweinfo.com/9890-2/ (дата обращения: 17.12.2025). — Текст : электронный.
5. Приготовление иммунодиагностических реагентов : сайт / ФГБНУ
«Федеральный исследовательский центр картофеля имени А.Г. Лорха». – Московская
область, Люберцы, 2025. – . URL: https://potatocentre.ru/ (дата обращения:
29.12.2025). — Текст : электронный.
6. ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ СИСТЕМА ИХА – КРАТКАЯ ИНСТРУКЦИЯ / Н.В.
Блажко, ООО НИЦ «Инновации». – Новосибирск, 2025. – 100 экз. – Текст :
непосредственный.
|
