| Аннотация |
Несмотря на прогресс в лечении злокачественных опухолей метастазирование остается одной из основных плохо решаемых проблем и основной причиной гибели пациентов. Поэтому все больше внимания уделяется поиску возможностей, позволяющих остановить диссеминацию опухолевых клеток (ОК), для этого важно представлять молекулярные механизмы, регулирующие миграцию ОК. Благодаря развитию новых технологий стало возможным выявлять мутации, стимулирующие развитие опухолей. Среди таких мутаций – нарушения в сигнальном пути фосфатидилинозитол-3-киназы (PI3K). В норме PI3K-зависимый сигнальный путь регулирует множество жизненно-важных процессов, таких как метаболизм, пролиферацию и способность клеток к выживанию, устойчивость ОК к
апоптозу. Влияние нарушений в PI3K-зависимом сигнальном пути на миграционные способности ОК исследовано мало.
Цель проекта - анализ миграционного поведения эпителиальных клеток молочной железы с мутациями сигнального пути PI3K (активирующими мутациями PIK3CA Н1047, PIK3CA Е545, AKT E17R и нокаутом PTEN), и выявление молекулярных механизмов, вовлеченных в регуляцию изменений подвижности. В процессе подготовки проекта мы
получили клетки молочной железы MCF10A с указанными мутациями и начали проверку их миграционной активности.
Мы показали, что нокаут PTEN приводит к увеличению эффективности миграции за счет коллективного движения, про влияние остальных мутаций данных нет. В ходе выполнения проекта мы охарактеризуем миграционную активность полученных мутантных клеток, используя несколько подходов: Проверим эффективность миграции клеток методом зарастания экспериментальной раны. Миграция клеток будет регистрироваться с помощью видеомикроскопии, далее полученные видеофильмы будут обработаны с применением компьютерной программы PIV (Particle Image
Velocimetry). Такой анализ позволит подробно охарактеризовать движение клеток (скорость, направленность движения, степень скоординированности миграции и т.д.). Это даст возможность выделить критерии, оказывающие наибольшее влияние на общую эффективность миграции и в дальнейшем поможет разработать программу, на основе
которой при анализе миграции клеток первичных опухолей можно будет предсказать их метастатический потенциал. Такая программа может быть использована при персонализированной терапии опухолей, помогая оптимизировать схему лечения. С помощью иммунофлуоресценции будут охарактеризованы изменение цитоскелета и межклеточных контактов мутантных клеток, с помощью Вестерн-блоттинга выясним изменение экспрессии белков, регулирующих клеточную подвижность и маркеров эпителио-мезенхимального перехода. Мы планируем использовать высокоспецифичные ингибиторы - CI1040 (ингибитор MEK) и LY294002 (ингибитор PI3K/Akt) для выяснения вопроса, какой из PI3K-зависимых путей задействован в регуляции миграции клеток. Еще одним новым подходом, который мы собираемся применить, является анализ динамики активности киназы ERK (один из эффекторов PI3K) при миграции мутантных клеток. Активация ERK ведет к усилению миграции клеток, для эффективной миграции нормального эпителия нужны волнообразные флуктуации активности ERK. Как изменяется активность ERK при движении ОК неизвестно. Этот сигнальный путь может быть важен при миграции ОК, поэтому с применением нового метода (трансфекции клеток плазмидой-биосенсором ERK-KTR, который меняет локализацию в клетке в зависимости от активации ERK), мы рассчитываем выяснить динамику активности ERK при миграции мутантных клеток.
В результате выполнения проекта мы рассчитываем: 1. Выяснить, каким образом мутации сигнального пути PI3K/AKT влияют на миграционный потенциал опухолевых клеток, какие пути задействованы при этих мутациях и какими ингибиторами можно затормозить увеличение миграционной подвижности при той или иной мутации; 2. Предложить компьютерную программу, с помощью которой, анализируя первичную культуру опухолевых клеток, можно оценить метастатический потенциал конкретной опухоли и выработать наиболее адекватную схему лечения.
|
