| Аннотация |
Экстремофильные прокариоты, изучаются уже более 40 лет в силу адаптаций к суровым условиям обитания, роли в эволюции биосферы и, конечно, потенциала для биотехнологии. Однако до сих пор многие аспекты их метаболизма изучены весьма слабо. В данном проекте мы сфокусировались на гало(алкало)фильных и (гипер)термофильных археях и бактериях, разлагающих “кислые” полисахариды и отвечающих за эти процессы ферментах – полисахаридлиазах (ПЛазах). ПЛазы расщепляют полисахариды, содержащие уроновые кислоты (пектин, альгинат, гиалуронан, и др.), с образованием ненасыщенных уроновых кислотных остатков. Их активно используют в пищевой и текстильной промышленности, в качестве компонентов средств бытовой химии. Также ПЛазы могут быть применены в косметологии и при получении биотоплива и удобрений из водорослей. Их изучение является крайне актуальным, что подтверждается большим количеством статей (> 13 тыс.), однако большинство исследований посвящено ферментам из мезофильных морских, почвенных и патогенных бактерий. С другой стороны, проводятся попытки увеличить их термостабильность и устойчивость к щелочным условиям и детергентам с помощью модификаций. Мы же считаем, что более продуктивным подходом будет получение ПЛаз из экстремофилов, так как они уже приспособлены к работе в жестких условиях. Несмотря на то, что ПЛазы активно изучаются, работ по таким ферментам из экстремофилов крайне мало: например, пектат-лиазы из Caldicellulosiruptor bescii, гиалуронан-лиаза из Thermasporomyces composti, альгинат-лиаза из Defluviitalea phaphyphila. Исследований, посвященных характеристике ПЛаз из умеренно галофильных бактерий, нами не было найдено, при этом среди них известны организмы, растущие на пектине. Более того, совсем ничего неизвестно о функциях ПЛаз у архей. В то же время стоит отметить, что в ходе предыдущих исследований, нами были обнаружены гены некоторых семейств полисахаридлиаз в геномах термофильных планктомицетов (Tepidisphaera mucosa и др.), веррукомикробов (Fontisphaera persica), галофильных актинобактерий (Natronosporangium hydrolyticum), а также экстремально галофильных архей (Natronoglomus mannanivorans и др.). Таким образом, несмотря на интенсивное изучение экстремофилов, существует значительный пробел в знаниях об их полисахаридлиазах. Данный проект направлен на исследование разнообразия и функции ПЛаз у гало(алкало)фильных и (гипер)термофильных архей и бактерий. Планируемые работы основаны на микробиологических, биоинформатических и биохимических методах: 1) получение накопительных культур экстремофильных прокариот, растущих на полисахаридах, содержащих уроновые кислоты, растительного и животного происхождения 2) выделение новых изолятов из полученных накопительных культур 3) проверка способности расти на “кислых” полисахиридах и/или проявлять лиазную активность у культур экстремофилов из коллекций заявителей 4) секвенирование и анализ геномов чистых культур выделенных в ходе проекта 5) поиск генов ПЛаз в геномах, в том числе и полученных в ходе настоящего проекта; филогенетический анализ ПЛаз 6) клонирование генов целевых ферментов для гетерологичной экспрессии в Escherichia coli 7) очистка рекомбинантных ПЛаз и их характеристика (определение оптимальных физико-химических условий, субстратной специфичности, устойчивости к соли, щелочности и детергентам, термостабильности). 8) анализ структур исследуемых ПЛаз с целью выявления особенностей, позволяющих сохранять активность в жестких условиях Подобный комплексный подход приведет к получению качественных результатов, позволяющих глубже изучить метаболизм экстремофильных прокариот. Кроме того, биохимическая характеристика полисахаридлиаз из экстремофилов даст возможность найти белки с ценными свойствами (устойчивость к высоким концентрациям соли, экстремальным значения pH и детергентам, высокая термостабильность). С учетом широкого спектра применения ПЛаз можно полагать, что эти ферменты из экстремофилов обладают значительным потенциалом для биотехнологии.
|
